Dkk-3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402970-ACT

O DKK3 humano codifica a proteína 3 relacionada a Dickkopf (Dkk-3), uma glicoproteína secretada implicada na regulação da sinalização Wnt/β-catenina e no controle mais amplo de decisões de destino celular, diferenciação e remodelação tecidual. A atividade de Dkk-3 tem sido associada à modulação da transição epitélio–mesênquima, das interações com a matriz extracelular e de vias responsivas ao estresse que influenciam a proliferação e a apoptose. Padrões alterados de expressão de DKK3 foram relatados em múltiplos contextos tumorais e em microambientes fibróticos e inflamatórios, sustentando seu uso como um nó mecanístico para estudar a comunicação cruzada entre vias e saídas de sinalização dependentes do contexto. Como um membro não canônico da família Dickkopf, a Dkk-3 oferece um ponto de entrada útil para dissecar programas transcricionais associados à via Wnt e a biologia de fatores secretados em células humanas.

Dkk-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DKK3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Dkk-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DKK3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DKK3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Dkk-3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DKK3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Dkk-3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Dkk-3 em células tumorais com expressão de DKK3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.