Dkk-3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402970-ACT

Das humane DKK3 kodiert das Dickkopf-verwandte Protein 3 (Dkk-3), ein sezerniertes Glykoprotein, das an der Regulation der Wnt/β‑Catenin-Signalgebung sowie allgemein an der Kontrolle von Zellschicksalsentscheidungen, Differenzierung und Gewebeumbau beteiligt ist. Die Aktivität von Dkk-3 wurde mit der Modulation der epithelial-mesenchymalen Transition, mit Interaktionen der extrazellulären Matrix und mit stressantwortlichen Signalwegen in Verbindung gebracht, die Proliferation und Apoptose beeinflussen. Veränderte DKK3-Expressionsmuster wurden in verschiedenen Tumorkontexten sowie in fibrotischen und entzündlichen Mikroumgebungen beschrieben, was seine Nutzung als mechanistischen Knotenpunkt zur Untersuchung von Signalweg-Crosstalk und kontextabhängigen Signalausgängen unterstützt. Als nicht-kanonisches Mitglied der Dickkopf-Familie bietet Dkk-3 einen nützlichen Zugang, um Wnt-assoziierte Transkriptionsprogramme und die Biologie sezernierter Faktoren in humanen Zellen zu analysieren.

Dkk-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DKK3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Dkk-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DKK3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DKK3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Dkk-3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DKK3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Dkk-3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Dkk-3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DKK3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.