Plasmide CRISPR d'Activation (h) DGK-ε: sc-404387-ACT

DGKE code la diacylglycérol kinase epsilon (DGK-ε), une kinase lipidique qui phosphoryle le diacylglycérol pour produire de l’acide phosphatidique, modulant la signalisation par seconds messagers et la composition lipidique des membranes. DGK-ε présente une sélectivité de substrat pour le diacylglycérol contenant un groupement arachidonoyle, ce qui la relie au cycle des phosphoinositides et à la régulation des cascades de signalisation dépendantes de la PKC. En contrôlant l’équilibre DAG/PA, DGK-ε influence des processus tels que la transduction du signal aux membranes, les réponses au stress cellulaire et la signalisation inflammatoire. Une activité altérée de DGKE a été associée à la microangiopathie thrombotique et à des atteintes rénales, soulignant sa pertinence pour des études mécanistiques de la biologie vasculaire et rénale.

DGK-ε Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DGKE sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DGK-ε Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DGKE dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DGKE, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DGK-ε. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DGKE natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DGK-ε au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DGK-ε dans les cellules tumorales présentant une expression de DGKE silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.