DGAT1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401735-ACT

Die Diacylglycerol-O-Acyltransferase 1 (DGAT1) ist ein im endoplasmatischen Retikulum lokalisiertes Enzym, das den letzten Schritt der Triacylglycerol-Synthese katalysiert, indem es Diacylglycerol mit Fettsäure-Acyl-CoA acyliert. Über diese entscheidende Reaktion der Neutralfettproduktion koordiniert DGAT1 die Biogenese von Lipidtröpfchen, die Pufferung von Fettsäuren und die zelluläre Energiespeicherung und greift dabei in den Glycerolipidstoffwechsel sowie in Programme zur Anpassung an ER-Stress ein. Die DGAT1-Aktivität beeinflusst die Assemblierung von Lipoproteinen und die intestinale Lipidaufnahme und verknüpft ihre Regulation mit dem systemischen Lipidhaushalt. Eine veränderte DGAT1-Expression oder -Funktion wurde mit metabolischer Dysregulation und lipidvermittelten zellulären Stressphänotypen in Verbindung gebracht, die in Forschungsmodellen zu Adipositas, Insulinresistenz und hepatischer Steatose relevant sind.

DGAT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DGAT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DGAT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DGAT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DGAT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DGAT1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DGAT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DGAT1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DGAT1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DGAT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.