Dermatopontin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402924-ACT

Das humane DPT kodiert Dermatopontin, ein Protein der extrazellulären Matrix (ECM), das an Kollagene bindet und fibrilläre Netzwerke auskleidet, um die Matrixorganisation, die Zell-Matrix-Adhäsion und die biomechanischen Eigenschaften von Bindegeweben zu beeinflussen. Dermatopontin trägt zum Verhalten von Fibroblasten und zum ECM-Remodeling bei, indem es Interaktionen zwischen Kollagenfibrillen, Proteoglykanen und Zelloberflächenrezeptoren moduliert und damit Prozesse wie Wundheilung und die stromale Architektur unterstützt. Eine veränderte DPT-Expression und ECM-Zusammensetzung werden häufig im Kontext von Fibrose, tumorassoziiertem Stroma sowie vaskulärem oder dermalem Remodeling untersucht, bei denen Veränderungen der Kollagenorganisation und der zellulären Adhäsion die Gewebefunktion beeinflussen. Als matrixassoziierter Regulator ist DPT zudem relevant für Studien zum TGF-β-getriebenen Remodeling und zu umfassenderen, mit Mechanotransduktion verknüpften Transkriptionsprogrammen.

Dermatopontin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DPT-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Dermatopontin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DPT-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DPT-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Dermatopontin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DPT-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Dermatopontin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Dermatopontin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DPT-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.