Derlin-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404762-ACT

DERL1 kodiert Derlin-1, eine Membrankomponente des endoplasmatischen Retikulums (ER) der ER-assoziierten Degradationsmaschinerie (ERAD), die die Retrotranslokation fehlgefalteter luminaler und membranständiger Proteine zum Abbau über das Ubiquitin-Proteasom-System erleichtert. Derlin-1 wirkt an der Kontrolle der Proteostase sowohl unter basalen Bedingungen als auch bei ER-Stress mit und ist mit Qualitätskontrollwegen wie der Unfolded-Protein-Response sowie dem Abbau aberranter Glykoproteine verknüpft. Durch die Regulation der Entsorgung fehlgefalteter oder nicht assemblierten Proteine beeinflusst DERL1 die zelluläre Anpassung an sekretorische Belastung, Redox-Ungleichgewichte und proteotoxischen Stress. Eine veränderte DERL1-Expression wurde in mehreren Krankheitskontexten beschrieben, die durch chronischen ER-Stress und eine dysregulierte Protein-Homöostase gekennzeichnet sind, was seine Eignung als mechanistischen Knotenpunkt zur Untersuchung von Stresssignalwegen und proteasomgekoppelter Clearance unterstützt.

Derlin-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DERL1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Derlin-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DERL1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DERL1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Derlin-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DERL1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Derlin-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Derlin-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DERL1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.