DDX36 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404744-ACT

DHX36 kodiert die humane RNA/DNA-Helikase DDX36, eine DEAH-Box-Helikase, die bevorzugt an G-Quadruplex-Strukturen in RNA und DNA bindet und diese auflöst. Durch das Entwinden dieser Sekundärstrukturen trägt DDX36 zur Regulation transkriptioneller und posttranskriptioneller Programme bei, darunter mRNA-Abbau, Translation und die Aufrechterhaltung der Genomstabilität. Das Protein wird mit der Kontrolle der Zellproliferation und der stressinduzierten Genexpression in Verbindung gebracht – Prozesse, die bei Krebs und anderen Erkrankungen häufig gestört sind, wenn die G-Quadruplex-vermittelte Regulation verändert ist. Die Funktion von DDX36 ist zudem für Signalwege relevant, die den RNA-Stoffwechsel und die Überwachung von Nukleinsäuren steuern und so onkogene Signalübertragung sowie zelluläre Differenzierungszustände prägen.

DDX36 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DHX36-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DDX36 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DHX36-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DHX36-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DDX36-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DHX36-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DDX36-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DDX36-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DHX36-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.