DDAH II CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403032-ACT

Das humane DDAH2-Gen kodiert Dimethylarginin-Dimethylaminohydrolase II (DDAH II), ein zytosolisches Enzym, das asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA) und L‑NMMA zu Citrullin und Dimethylamin hydrolysiert und dadurch die Aktivität der Stickstoffmonoxid-Synthase sowie die Bioverfügbarkeit von Stickstoffmonoxid (NO) reguliert. Über die Kontrolle des Methylarginin-Stoffwechsels ist DDAH II in endotheliale Signalwege, redoxsensitive Prozesse und Pfade der vaskulären Homöostase eingebunden, die den Tonus der glatten Muskulatur und inflammatorische Signalgebung beeinflussen. Eine veränderte Expression oder Aktivität von DDAH2 wurde mit gestörter NO-Signalgebung und Phänotypen endothelialer Dysfunktion in Verbindung gebracht. Diese Mechanismen machen DDAH2 zu einem relevanten Ziel für die Untersuchung kardiometabolischer Stressantworten, vaskulärer Entzündung und NO-abhängiger zellulärer Programme in humanen Modellsystemen.

DDAH II Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DDAH2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DDAH II Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DDAH2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DDAH2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DDAH II-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DDAH2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DDAH II-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DDAH II-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DDAH2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.