DBC-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403056-ACT

CCAR2 kodiert Deleted in Breast Cancer 1 (DBC-1), ein nukleäres regulatorisches Protein, das Transkriptionsprogramme moduliert, indem es mit chromatinassoziierten Faktoren und metabolischen Sensoren interagiert. DBC-1 beeinflusst acetylierungsabhängige Signalwege durch die Regulation der Sirtuin-Aktivität und arbeitet mit nukleären Rezeptoren sowie transkriptionellen Ko‑Regulatoren zusammen, um die Zellzykluskontrolle, DNA-Schadensantworten und die Expression apoptosebezogener Gene zu steuern. Über diese Funktionen ist CCAR2/DBC-1 mit Signalwegen verknüpft, die Genomstabilität und Stressanpassung regulieren, und ist damit relevant für Studien zur tumorassoziierten transkriptionellen Umprogrammierung und zur zellulären Seneszenz. Eine veränderte CCAR2-Expression oder DBC-1-Interaktionsnetzwerke wurden in mehreren Krebszusammenhängen beschrieben und sind auch für die Untersuchung des metabolisch‑epigenetischen Crosstalks in humanen Zellen von Interesse.

DBC-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CCAR2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DBC-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CCAR2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CCAR2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DBC-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CCAR2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DBC-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DBC-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CCAR2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.