CYP27B1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401155-ACT

CYP27B1 kodiert die mitochondriale 25-Hydroxyvitamin-D-1α-Hydroxylase, ein Cytochrom-P450-Enzym, das die Umwandlung von 25-Hydroxyvitamin D in das aktive Hormon 1,25-Dihydroxyvitamin D3 katalysiert. Durch die Steuerung der lokalen und systemischen Calcitriol-Produktion reguliert CYP27B1 Signalprogramme des Vitamin-D-Rezeptors, die mit der Homöostase von Calcium und Phosphat, der epithelialen Differenzierung und der Immunmodulation verknüpft sind. Die Aktivität von CYP27B1 integriert endokrine und parakrine Stoffwechselwege, einschließlich der renalen und extrarenalen Vitamin-D-Aktivierung, und ist innerhalb des Steroid-/Vitamin-D-Stoffwechsels an mitochondriale Redox-Partner gekoppelt. Eine Fehlregulation oder Loss-of-Function-Varianten in CYP27B1 sind mit einer beeinträchtigten Vitamin-D-Aktivierung und erblichen Störungen des Mineralstoffwechsels assoziiert und bieten einen mechanistischen Ansatzpunkt zur Untersuchung Vitamin-D-abhängiger transkriptioneller Netzwerke in menschlichen Zellmodellen.

CYP27B1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CYP27B1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CYP27B1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CYP27B1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CYP27B1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CYP27B1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CYP27B1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CYP27B1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CYP27B1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CYP27B1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.