CstF-77 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404038-ACT

CSTF3 kodiert die 77-kDa-Untereinheit des Cleavage Stimulation Factor (CstF-77), eine zentrale Komponente der prä-mRNA-3′-Endverarbeitungsmaschinerie, die Spaltung und Polyadenylierung mit der Termination der Transkription koppelt. Indem CstF-77 die Erkennung von Poly(A)-Signalen mit anderen CPA-Faktoren koordiniert, trägt es über alternative Polyadenylierung und die Kontrolle der 3′-UTR-Länge dazu bei, Transkriptstabilität, nukleären Export und die Proteinproduktion zu bestimmen. Störungen in Dosierung oder Aktivität von CPA-Faktoren können die globale Auswahl von Poly(A)-Stellen verschieben und Genexpressionsnetzwerke umprogrammieren, die Proliferation, Differenzierung und Stressantworten steuern. Entsprechend wird CSTF3 häufig im Kontext einer fehlregulierten RNA-Prozessierung und ihrer Assoziationen mit onkogenen transkriptionellen Zuständen sowie weiter gefassten Genexpressionsanomalien untersucht.

CstF-77 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CSTF3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CstF-77 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CSTF3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CSTF3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CstF-77-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CSTF3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CstF-77-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CstF-77-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CSTF3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.