cSHMT CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403678-ACT

Das humane SHMT1 kodiert die zytosolische Serin-Hydroxymethyltransferase (cSHMT), ein pyridoxalphosphatabhängiges Enzym, das die reversible Umwandlung von Serin zu Glycin katalysiert und dabei 5,10‑Methylen‑Tetrahydrofolat für den Ein-Kohlenstoff-Stoffwechsel erzeugt. cSHMT verknüpft die folatabhängige Nukleotidbiosynthese mit der Methylierungskapazität, indem es Ein-Kohlenstoff-Einheiten für die Thymidylat- und Purinsynthese bereitstellt und redoxsensitiven metabolischen Fluss koordiniert. Über seine Funktion in Folat-/Ein-Kohlenstoff‑Signalwegen beeinflusst SHMT1 die Genauigkeit von DNA-Replikation und -Reparatur, die epigenetische Regulation sowie zelluläre Reaktionen auf die Nährstoffverfügbarkeit. Eine Fehlregulation dieser Achse wird häufig in Modellen proliferativen Stresses und metabolischer Reprogrammierung untersucht, mit Implikationen für krankheitsassoziierte Phänotypen im Zusammenhang mit genomischer Stabilität.

cSHMT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SHMT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

cSHMT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SHMT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SHMT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen cSHMT-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SHMT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von cSHMT-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des cSHMT-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SHMT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.