Plasmide CRISPR d'Activation (h) CPOX: sc-405130-ACT

Le gène humain **CPOX** code la coproporphyrinogène oxydase, une enzyme mitochondriale de la voie de biosynthèse de l’hème qui catalyse la conversion du coproporphyrinogène III en protoporphyrinogène IX. En soutenant la disponibilité cellulaire en hème, CPOX influence la respiration mitochondriale, la fonction des cytochromes, l’homéostasie redox et la détection de l’oxygène dans les tissus à forte activité métabolique. Une activité de CPOX dérégulée perturbe le flux des porphyrines et peut modifier les intermédiaires porphyriniques intracellulaires, ce qui affecte le stress oxydant et la signalisation métabolique. La perturbation génétique et biochimique de ce nœud est pertinente pour les troubles du métabolisme des porphyrines ainsi que pour les études mécanistiques du dysfonctionnement mitochondrial dans des modèles cellulaires et tissulaires.

CPOX Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CPOX sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CPOX Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CPOX dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CPOX, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CPOX. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CPOX natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CPOX au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CPOX dans les cellules tumorales présentant une expression de CPOX silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.