Plasmide CRISPR d'Activation (h) connexin 46: sc-403947-ACT

GJA3 code la connexine 46, une protéine de jonctions gap enrichie dans le cristallin, qui s’assemble en hémicanaux et en canaux intercellulaires afin de permettre l’échange direct d’ions et de métabolites entre cellules. En favorisant le couplage des fibres du cristallin, la connexine 46 contribue au maintien de l’homéostasie ionique, de l’équilibre rédox et de la coordination métabolique nécessaires à la transparence du cristallin. Une altération de la fonction de la connexine 46 perturbe la communication via les jonctions gap et est associée à des phénotypes de cataracte héréditaire ainsi qu’à une physiologie du cristallin altérée. Dans des modèles cellulaires, l’activité de GJA3 est couramment étudiée sous l’angle du trafic membranaire, du gating (ouverture/fermeture) des canaux et des voies de réponse au stress qui influencent la protéostase et les dommages oxydatifs.

connexin 46 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GJA3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

connexin 46 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GJA3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GJA3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de connexin 46. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GJA3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de connexin 46 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie connexin 46 dans les cellules tumorales présentant une expression de GJA3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.