connexin 43 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400241-ACT

GJA1 kodiert Connexin 43 (Cx43), ein wichtiges Gap-Junction-Protein, das sich zu Halbkanälen (Hemikanälen) und interzellulären Kanälen zusammensetzt und so den direkten Austausch von Ionen und kleinen Metaboliten zwischen Zellen vermittelt. Durch die Regulation der elektrischen Kopplung, der Kalziumsignalgebung und der Diffusion von Second Messengern beeinflusst Cx43 die Gewebehomöostase, die koordinierte Kontraktion, die Wundheilung und die Entwicklungsmusterbildung. Die Funktion von Connexin 43 ist in Adhäsions- und Zytoskelettnetzwerke eingebunden und wird durch phosphorylierungsabhängigen Transport und Abbau moduliert. Eine veränderte GJA1-Expression oder ein verändertes Channel-Gating von Connexin 43 ist mit gestörter interzellulärer Kommunikation bei kardialen Reizleitungsstörungen, Neuroinflammation und der Invasivität von Krebszellen verbunden, was GJA1/Cx43 zu einem häufigen Ziel in Studien zur Zellsignalgebung und zu Krankheitsmechanismen macht.

connexin 43 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GJA1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

connexin 43 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GJA1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GJA1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen connexin 43-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GJA1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von connexin 43-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des connexin 43-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GJA1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.