claudin-3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401756-ACT

CLDN3 kodiert Claudin-3, ein tetraspanes Tight-Junction-Protein, das zur Integrität der epithelialen Barriere und zur apikal-basolateralen Polarität beiträgt, indem es die parazelluläre Permeabilität und die Architektur der Tight-Junction-Stränge reguliert. Claudin-3 wirkt mit anderen Claudinen und junctionalen Gerüstproteinen zusammen, um Zell-Zell-Adhäsion und Signalwege zu koordinieren, die mit der epithelialen Homöostase verbunden sind, einschließlich einer Wechselwirkung mit EMT-assoziierten Umbauprogrammen. Eine veränderte CLDN3-Expression und Desorganisation von Tight Junctions sind häufig mit der Biologie epithelialer Tumoren assoziiert, wobei Veränderungen der Barrierefunktion und Polarität Invasion, Metastasierung und Interaktionen mit dem Mikromilieu beeinflussen können. Als membranassoziierte junctionale Komponente ist Claudin-3 zudem relevant für Studien zur Gewebekompartimentierung, zum Arzneistofftransport über Epithelien sowie zu linien-/zelltypspezifischen Differenzierungszuständen.

claudin-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CLDN3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

claudin-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CLDN3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CLDN3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen claudin-3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CLDN3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von claudin-3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des claudin-3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CLDN3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.