CHD7 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404017-ACT

CHD7 (Chromodomain-Helicase-DNA-bindendes Protein 7) ist ein ATP-abhängiger Chromatin-Remodeler, der über seine Chromodomänen Histonmarkierungen ausliest und dadurch die Zugänglichkeit von Enhancern und Promotoren reguliert. In menschlichen Zellen koordiniert CHD7 Transkriptionsprogramme, die die Festlegung von Zelllinien, die Entwicklung der Neuralleiste und die Organogenese prägen, indem es die Nukleosomenpositionierung und die höhergeordnete Chromatinarchitektur moduliert. Die Funktion von CHD7 überschneidet sich mit zentralen epigenetischen und transkriptionellen Regulationswegen und beeinflusst die durch RNA-Polymerase II gesteuerte Genexpression sowie Chromatinzustands-Übergänge während der Differenzierung. Genetische Störungen oder veränderte Dosierung von CHD7 sind mit Phänotypen von Entwicklungsstörungen verbunden, einschließlich des CHARGE-Syndroms, und seine Fehlregulation wird in neuroentwicklungsbezogenen und krebsassoziierten transkriptionellen Netzwerken untersucht.

CHD7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CHD7-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CHD7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CHD7-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CHD7-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CHD7-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CHD7-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CHD7-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CHD7-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CHD7-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.