Cdt1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401014-ACT

Il gene umano **CDT1** codifica **Cdt1**, un fattore di “licensing” della replicazione del DNA che carica l’elicasi **MCM2–7** sulle origini di replicazione durante la tarda mitosi e la fase **G1**, per garantire un ingresso tempestivo nella fase **S**. L’attività di Cdt1 è strettamente regolata dalla fosforilazione dipendente da **CDK**, dal legame con **geminina** e dalla proteolisi mediata da ubiquitina tramite le vie **CRL4^Cdt2** e **SCF^Skp2**, al fine di prevenire la rireplicazione e preservare la stabilità del genoma. La disregolazione di **CDT1** può indurre stress replicativo, un’attivazione anomala delle origini e l’attivazione della segnalazione di danno al DNA, processi spesso associati all’instabilità cromosomica nel cancro e in altri disturbi proliferativi. In quanto componente centrale della rete di licensing delle origini, Cdt1 è ampiamente studiata nel controllo del ciclo cellulare, nelle risposte ai checkpoint e nella riparazione del DNA accoppiata alla replicazione.

Cdt1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CDT1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Cdt1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CDT1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CDT1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Cdt1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CDT1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Cdt1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Cdt1 nelle cellule tumorali con espressione di CDT1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.