Cdc27 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400789-ACT

CDC27 kodiert Cdc27, eine zentrale Untereinheit des Anaphase-Promoting-Complex/Cyclosome (APC/C), einer E3-Ubiquitin-Ligase, die den geordneten Abbau wichtiger mitotischer Regulatoren steuert, um eine korrekte Chromosomensegregation und reibungslose Zellzyklusübergänge zu gewährleisten. Über die APC/C-abhängige Ubiquitinierung von Substraten wie Securin und Cyclinen trägt Cdc27 zur Koordination des Spindelkontrollpunkts (Spindle-Checkpoint), des Mitoseaustritts und zur Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität bei. Eine Fehlregulation von APC/C-Komponenten und der Checkpoint-Kontrolle wird mit chromosomaler Instabilität und proliferativen Phänotypen in verschiedenen Tumorkontexten in Verbindung gebracht, was CDC27 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung der Mitosekontrolle und der Dynamik des Ubiquitin-Proteasom-Systems macht. Das humane CDC27 wird daher häufig in Studien zur zeitlichen Steuerung der Zellteilung, zur Checkpoint-Treue und zu Signalwegen eingesetzt, die Proteostase mit der Genomstabilität verknüpfen.

Cdc27 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CDC27-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Cdc27 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CDC27-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CDC27-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Cdc27-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CDC27-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Cdc27-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Cdc27-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CDC27-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.