CD73 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400307-ACT

NT5E codifica o CD73 (ecto-5′-nucleotidase), uma ectoenzima ancorada por GPI que hidrolisa o AMP extracelular em adenosina e fosfato inorgânico, moldando a sinalização purinérgica no microambiente tecidual. Ao controlar a disponibilidade local de adenosina, o CD73 modula vias de GPCR ligadas ao cAMP e influencia a ativação de células imunes, a permeabilidade vascular e as interações plaqueta–endotélio. A atividade do CD73 contribui para a regulação da inflamação e de respostas associadas à hipóxia e é amplamente utilizada como marcador de estados de células estromais e endoteliais. A expressão ou função desregulada de NT5E/CD73 tem sido associada a alterações na regulação imune e a um remodelamento tecidual aberrante em múltiplos contextos relevantes para doenças.

CD73 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NT5E sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CD73 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NT5E em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NT5E, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CD73. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NT5E nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CD73 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CD73 em células tumorais com expressão de NT5E silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.