Plasmide CRISPR d'Activation (h) CaM II: sc-400952-ACT

Le gène humain **CALM2** code la calmoduline (CaM II), un capteur ubiquitaire du Ca2+ qui convertit les transitoires calciques intracellulaires en signaux régulateurs en se liant à de nombreuses enzymes, canaux ioniques et régulateurs de la transcription, et en modulant leur activité. Via la signalisation dépendante du Ca2+/calmoduline, elle contribue à des processus tels que le couplage excitation–contraction, la plasticité synaptique, le contrôle du cycle cellulaire et l’expression génique dépendante des stimuli, en s’intégrant à des voies comme la signalisation CaMK, l’activation calcineurine/NFAT et les dynamiques de Ca2+ initiées par les GPCR. Le tamponnement et le décodage des signaux Ca2+ médiés par CALM2 soutiennent la fonction mitochondriale et l’excitabilité membranaire, façonnant les réseaux de phosphorylation en aval ainsi que l’homéostasie calcique. Une signalisation de la calmoduline dérégulée et des variants pathogènes de CALM2 ont été associés à des phénotypes arythmogènes et, plus largement, à des dysfonctions neurocardiaques, faisant de CALM2 une cible pertinente pour des études mécanistiques de la biologie des maladies liées au calcium.

CaM II Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CALM2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CaM II Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CALM2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CALM2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CaM II. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CALM2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CaM II au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CaM II dans les cellules tumorales présentant une expression de CALM2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.