calsequestrin 1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403375-ACT

CASQ1 kodiert Calsequestrin 1, ein Ca2+-bindendes Protein mit hoher Bindekapazität, das im Lumen des sarkoplasmatischen Retikulums in schnellzuckender Skelettmuskulatur lokalisiert ist. Durch Pufferung und Freisetzung von luminalem Ca2+ unterstützt Calsequestrin 1 die Erregungs‑Kontraktions‑Kopplung und trägt zur Ausprägung der durch den Ryanodinrezeptor vermittelten Ca2+-Freisetzungsdynamik bei. Damit beeinflusst es die Calciumhomöostase, die Muskelkontraktilität und die Stabilität der Ca2+-Speicher des SR. Störungen der CASQ1-Funktion wurden mit veränderter intrazellulärer Ca2+-Signalübertragung und Stressantworten in der Skelettmuskulatur in Verbindung gebracht und bieten einen mechanistischen Ansatzpunkt zur Untersuchung Ca2+-abhängiger Signalwege, der Proteostase und der Physiologie von Muskelfasern. Als zentraler Regulator der Ca2+-Pufferung im SR wird CASQ1 häufig in Modellen von Muskeldysfunktionen untersucht, bei denen eine abnorme Ca2+-Handhabung zur Pathologie beiträgt.

calsequestrin 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CASQ1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

calsequestrin 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CASQ1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CASQ1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen calsequestrin 1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CASQ1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von calsequestrin 1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des calsequestrin 1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CASQ1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.