BUBR1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403807-ACT

BUB1B codiert für BUBR1, eine zentrale Komponente des Spindelkontrollpunkts (Spindle Assembly Checkpoint, SAC), der die Chromosomentrennung absichert, indem er die Anheftung von Kinetochor und Mikrotubuli überwacht und die APC/C‑Aktivität über den mitotischen Checkpoint‑Komplex reguliert. BUBR1 trägt zum mitotischen Timing, zur Kohäsion der Schwesterchromatiden und zur Fehlerkorrektur bei und erhält so die Genomstabilität während der Zellteilung. Eine fehlregulierte BUB1B/BUBR1‑Funktion ist mit chromosomaler Instabilität und Aneuploidie assoziiert – Merkmalen, die in der Krebsbiologie und bei Entwicklungsstörungen mit beeinträchtigter Zellzykluskontrolle häufig untersucht werden. Als Checkpoint‑Regulator wird BUBR1 außerdem als mechanistischer Knotenpunkt genutzt, um mitotische Stressantworten und proliferationsabhängige Phänotypen zu untersuchen.

BUBR1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen BUB1B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BUBR1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des BUB1B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der BUB1B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BUBR1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native BUB1B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BUBR1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BUBR1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem BUB1B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.