BRAP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403847-ACT

BRAP (BRCA1-assoziiertes Protein) ist eine zytoplasmatische RING-Typ-E3-Ubiquitin-Ligase, die Proteinstabilität und Signalausgabe moduliert, indem sie die ubiquitinierungsabhängige Kontrolle von Komponenten verschiedener Signalwege koordiniert. BRAP wird mit der Regulation der Dynamik der MAPK/ERK-Signalübertragung in Verbindung gebracht und beeinflusst über Effekte auf ubiquitinvermittelten Proteinabbau und Signalabschwächung den Zellzyklus, Stressantworten und die Proteostase. Indem BRAP Signaltransduktion sowie Entzündungs- und Stresswege mitprägt, wurden BRAP-Expression und funktionelle Varianten mit veränderter zellulärer Homöostase und einer Anfälligkeit für krankheitsrelevante Phänotypen assoziiert, darunter kardiometabolische Prozesse und neurodegenerationsbezogene Mechanismen. Diese Eigenschaften machen BRAP zu einem nützlichen Ziel, um zu untersuchen, wie Ubiquitin-Ligase-Netzwerke phosphorylierungsgetriebene Signalwege und nachgeschaltete transkriptionelle Programme in menschlichen Zellen feinabstimmen.

BRAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen BRAP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BRAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des BRAP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der BRAP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BRAP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native BRAP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BRAP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BRAP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem BRAP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.