BBS2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404725-ACT

BBS2 kodiert eine zentrale Untereinheit des BBSom-Komplexes, einer multimeren Hülle, die den Proteintransport in der Zilienmembran sowie die Signalübertragungskompetenz der primären Zilie reguliert. Über Interaktionen mit der intraflagellären Transportmaschinerie und kleinen GTPasen trägt BBS2 zur Koordination von Cargo-Export/-Import und zur Rezeptor-Lokalisierung bei, was Signalwege wie Hedgehog und andere zilienabhängige Signalprogramme beeinflusst. Eine Störung von BBS2 beeinträchtigt die Ziliogenese und den zilienalen Transport und führt dadurch zu einer veränderten zellulären Homöostase in Geweben, die auf zilienvermittelte Signalgebung angewiesen sind. Varianten in BBS2 werden mit dem Bardet–Biedl-Syndrom und verwandten Ziliopathie-Phänotypen in Verbindung gebracht, wodurch es ein nützliches Ziel zur Untersuchung zilienvermittelter Krankheitsmechanismen darstellt.

BBS2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen BBS2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BBS2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des BBS2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der BBS2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BBS2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native BBS2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BBS2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BBS2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem BBS2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.