Plasmide CRISPR d'Activation (h) Atg4b: sc-404173-ACT

Le gène humain **ATG4B** code Atg4b, une protéase à cystéine qui catalyse la maturation et la dél lipidation des protéines de la famille **ATG8**, telles que **LC3** et **GABARAP**, permettant leur conjugaison à la phosphatidyléthanolamine et leur recyclage depuis les membranes autophagosomales. Par ces activités, Atg4b régule la biogenèse et la maturation des autophagosomes, ainsi que le flux de cargaison au sein des voies de macroautophagie et d’autophagie sélective. La fonction d’ATG4B influence la protéostase, le contrôle qualité des mitochondries et d’autres organites, ainsi que les réponses cellulaires au stress nutritif et à l’hypoxie. Une autophagie dépendante d’ATG4B dérégulée a été impliquée dans des contextes pertinents pour la biologie du cancer, la neurodégénérescence et l’infection, où une modification du renouvellement des agrégats protéiques et des organites endommagés peut remodeler la survie cellulaire et la signalisation inflammatoire.

Atg4b Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ATG4B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Atg4b Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ATG4B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ATG4B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Atg4b. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ATG4B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Atg4b au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Atg4b dans les cellules tumorales présentant une expression de ATG4B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.