Plasmide CRISPR d'Activation (h) Ataxin-3: sc-417498-ACT

ATXN3 code l’ataxine‑3, une enzyme de déubiquitination qui remodèle les chaînes d’ubiquitine et contribue à réguler le contrôle qualité des protéines via le système ubiquitine–protéasome et des voies liées à l’autophagie. L’ataxine‑3 participe à la protéostasie et aux réponses au stress cellulaire en modulant la stabilité et le renouvellement de substrats mal repliés ou sujets à l’agrégation, avec des liens fonctionnels avec la régulation transcriptionnelle et la signalisation associée aux dommages de l’ADN. Des expansions de tracts polyglutamines dans ATXN3 sont associées à l’ataxie spinocérébelleuse de type 3 (maladie de Machado–Joseph), une maladie neurodégénérative caractérisée par l’agrégation protéique et une vulnérabilité neuronale. Ces propriétés font d’ATXN3 un nœud utile pour étudier la signalisation de l’ubiquitine, la biologie des agrégats et les voies qui gouvernent l’homéostasie neuronale.

Ataxin-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ATXN3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Ataxin-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ATXN3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ATXN3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Ataxin-3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ATXN3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Ataxin-3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Ataxin-3 dans les cellules tumorales présentant une expression de ATXN3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.