ARX CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402055-ACT

ARX (aristaless related homeobox) kodiert einen Homeobox-Transkriptionsfaktor, der Genexpressionsprogramme reguliert, die für die Proliferation neuraler Vorläuferzellen, die Differenzierung von Interneuronen und die regionale Musterbildung während der Entwicklung des Vorderhirns erforderlich sind. Durch sequenzspezifische DNA-Bindung und die Interaktion mit koregulatorischen Komplexen koordiniert ARX transkriptionelle Netzwerke, die die neuronale Migration und Reifung beeinflussen. Eine fehlregulierte ARX-Aktivität ist mit neuroentwicklungsbedingten Erkrankungen verknüpft, darunter X-chromosomal vererbte intellektuelle Beeinträchtigung und epilepsieassoziierte Phänotypen, weshalb ARX häufig Gegenstand von Studien zur genetischen Regulation während der Entwicklung ist. In humanen Zellmodellen stellt ARX einen gut untersuchbaren Ansatzpunkt dar, um zu analysieren, wie Dosierung und Timing von Transkriptionsfaktoren Zellschicksalsentscheidungen beeinflussen.

ARX Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ARX-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ARX Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ARX-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ARX-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ARX-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ARX-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ARX-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ARX-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ARX-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.