Arp2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401018-ACT

ACTR2 kodiert das humane aktinverwandte Protein Arp2, eine zentrale Untereinheit des Arp2/3-Komplexes, der verzweigte Aktinfilamente nucleiert und so das Zytoskelett umstrukturiert. Arp2/3-abhängige Aktindynamiken treiben die Bildung von Lamellipodien, Zellmigration, Endozytose und Phagozytose an und koordinieren sich mit Signalwegen der Rho-Familie von GTPasen sowie Adhäsionswegen, um Morphogenese und intrazellulären Transport zu regulieren. Über seine Rolle bei der Formgebung von Aktinnetzwerken beeinflusst ACTR2 Prozesse wie die Motilität von Immunzellen, den Umbau epithelialer Barrieren und den Vesikeltransport und ist damit relevant für Studien zu Invasion, metastaseassoziierten Phänotypen sowie neurodevelopmentalen oder zytoskelettalen Funktionsstörungen. Störungen in Signal- und Aufbauwegen der Aktinassemblierung werden häufig in Krebs- und Entzündungskontexten beobachtet, und ACTR2 bietet einen mechanistischen Ansatzpunkt, um diese zytoskelettgekoppelten Veränderungen zu untersuchen.

Arp2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ACTR2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Arp2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ACTR2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ACTR2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Arp2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ACTR2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Arp2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Arp2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ACTR2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.