Plasmide CRISPR d'Activation (h) ARD1: sc-402395-ACT

NAA10 code ARD1, la sous-unité catalytique du complexe d’acétyltransférase N-terminale NatA, qui acétyle de manière co-traductionnelle les polypeptides naissants et module la stabilité, la localisation et les interactions des protéines. Par l’acétylation N-terminale, ARD1 influence la protéostasie, la dynamique du cytosquelette et la signalisation en réponse au stress, en s’intégrant à des voies qui régulent la croissance et la survie cellulaires. Une activité altérée de NAA10/ARD1 a été associée à des programmes transcriptionnels dérégulés et à une homéostasie protéique aberrante, ce qui l’implique dans des phénotypes développementaux et des comportements cellulaires pertinents pour le cancer. En tant que régulateur de l’acétylation des protéines, ARD1 est fréquemment étudiée dans le contexte du contrôle qualité couplé à la traduction et d’un contrôle, de type épigénétique, de la fonction des protéines.

ARD1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NAA10 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ARD1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NAA10 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NAA10, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ARD1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NAA10 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ARD1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ARD1 dans les cellules tumorales présentant une expression de NAA10 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.