AP-3β Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-419135-ACT

Ap3b1 codifica a subunidade beta do complexo adaptador de proteínas 3 (AP-3β), um componente-chave do tráfego associado à clatrina que seleciona cargas transmembranares de endossomos para lisossomos e organelos relacionados a lisossomos. Em células de camundongo, vias dependentes de AP-3 sustentam a biogênese regulada de vesículas, a localização de proteínas de membrana e a entrega de carga, importantes para a homeostase endolisossomal e para compartimentos secretores especializados. A disrupção da função do complexo AP-3 está associada a defeitos no transporte intracelular e na maturação de organelos, processos que se cruzam com a biologia de grânulos de células imunes e com a proteostase neuronal. Como resultado, Ap3b1 é frequentemente estudado em modelos de disfunção do tráfego vesicular, fenótipos relacionados à pigmentação e a grânulos, e mecanismos neuroimunes envolvendo organelos relacionados a lisossomos.

AP-3β O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Ap3b1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

AP-3β O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Ap3b1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Ap3b1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de AP-3β. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Ap3b1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de AP-3β no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via AP-3β em células tumorais com expressão de Ap3b1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.