AP-3β CRISPR Activation Plasmid (m): sc-419135-ACT

Ap3b1 kodiert die Beta-Untereinheit des Adaptorkomplexes 3 (AP-3β), eine zentrale Komponente des clathrinassoziierten Transports, der transmembrane Fracht aus Endosomen zu Lysosomen und lysosomenverwandten Organellen sortiert. In Mauszellen unterstützen AP-3-abhängige Signalwege die regulierte Vesikelbiogenese, die Lokalisation von Membranproteinen und die Frachtzustellung, die für die endolysosomale Homöostase und spezialisierte sekretorische Kompartimente wichtig sind. Eine Störung der Funktion des AP-3-Komplexes wird mit Defekten im intrazellulären Transport und in der Organellenreifung in Verbindung gebracht – Prozesse, die sich mit der Granulatbiologie von Immunzellen und der neuronalen Proteostase überschneiden. Daher wird Ap3b1 häufig in Modellen für Störungen des vesikulären Transports, für Pigmentierungs- und granulatassoziierte Phänotypen sowie für neuroimmunologische Mechanismen untersucht, an denen lysosomenverwandte Organellen beteiligt sind.

AP-3β Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ap3b1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AP-3β Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ap3b1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ap3b1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AP-3β-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ap3b1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AP-3β-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AP-3β-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ap3b1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.