ALKBH8 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-426676-ACT

Mouse Alkbh8 kodiert ALKBH8, ein tRNA-modifizierendes Enzym, das die Genauigkeit der Translation unterstützt, indem es zentrale Schritte der Wobble-Uridin-Chemie katalysiert, darunter Methylierungen und oxidative Modifikationen, die die Codon-Decodierung beeinflussen. Über die Regulation der tRNA-abhängigen Decodierungseffizienz wirkt ALKBH8 auf die Protein-Homöostase und zelluläre Stressanpassungswege, insbesondere unter oxidativen und genotoxischen Bedingungen. Eine veränderte ALKBH8-Aktivität wurde mit fehlregulierten RNA-Modifikationslandschaften in Verbindung gebracht, die die Genomstabilität, Stressantwort-Signalwege und zelluläre Überlebensprogramme beeinflussen können, die für die Krebsbiologie und Modelle entzündlicher Gewebeschädigung relevant sind. Als Knotenpunkt der epitranskriptomischen Kontrolle der Translation wird Alkbh8 häufig im Kontext von Redox-Gleichgewicht, DNA-Schadensantworten und proteostase-assoziierten Phänotypen untersucht.

ALKBH8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Alkbh8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ALKBH8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Alkbh8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Alkbh8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ALKBH8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Alkbh8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ALKBH8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ALKBH8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Alkbh8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.