AKR1D1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404897-ACT

AKR1D1 kodiert die Steroid‑5β‑Reduktase, eine Aldo‑Keto‑Reduktase, die einen essenziellen Schritt der Gallensäurebiosynthese katalysiert, indem sie Δ4‑3‑Ketosteroide in 5β‑reduzierte Zwischenprodukte umwandelt. Diese Aktivität unterstützt den hepatischen Cholesterinabbau, die Gallensäurehomöostase sowie nachgeschaltete metabolische Signalwege über gallensäure‑responsive nukleäre Rezeptoren wie FXR und verknüpft AKR1D1 damit mit umfassenderen Regulationswegen des Lipid‑ und Glukosestoffwechsels. Eine veränderte AKR1D1‑Expression oder ‑Funktion kann die Gallensäurezusammensetzung und den Steroidstoffwechsel stören, was für cholestatische Phänotypen und metabolische Leberfunktionsstörungen relevant ist. Als leberangereichertes Enzym wird AKR1D1 häufig in Hepatozyten‑Modellen untersucht, um zu klären, wie Gallensäurefluss und Steroid‑Clearance inflammatorische und metabolische Stressantworten beeinflussen.

AKR1D1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AKR1D1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AKR1D1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AKR1D1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AKR1D1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AKR1D1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AKR1D1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AKR1D1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AKR1D1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AKR1D1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.