ADAR3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402742-ACT

ADARB2 kodiert ADAR3, eine in Neuronen angereicherte Adenosin-Deaminase, die auf RNA wirkt, doppelsträngige RNA bindet und mit der Regulation der RNA-Editier-Dynamik im Nervensystem in Verbindung steht. Im Rahmen der posttranskriptionellen Genregulation beeinflusst das A‑zu‑I‑RNA-Editing die Stabilität von Transkripten, alternatives Spleißen, miRNA-Targeting und das kodierende Potenzial und prägt dadurch synaptische Signalübertragung und neuronale Erregbarkeit. Obwohl ADAR3 im Vergleich zu ADAR1/ADAR2 allgemein als katalytisch eingeschränkt gilt, kann es den Zugang zu RNA-Substraten modulieren und wird im Kontext der Biologie neuroentwicklungsbezogener und neuropsychiatrischer Erkrankungen untersucht. Fehlregulierte RNA-Editing-Landschaften, die mit der Aktivität der ADAR-Familie assoziiert sind, wurden in verschiedenen neurologischen Erkrankungen und Hirntumoren beschrieben, was mechanistische Studien zur ADAR3-abhängigen RNA-Regulation in humanen Zellen vorantreibt.

ADAR3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ADARB2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ADAR3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ADARB2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ADARB2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ADAR3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ADARB2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ADAR3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ADAR3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ADARB2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.