ACAT-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402300-ACT

ACAT1 kodiert ACAT-1, eine mitochondriale Thiolase (Acetyl-CoA-Acetyltransferase 1), die die reversible Thiolyse von Acetoacetyl-CoA katalysiert und damit die Nutzung von Ketonkörpern mit der Bereitstellung von Acetyl-CoA für den oxidativen Stoffwechsel verknüpft. Dieses Enzym ist an der mitochondrialen Lipid- und Aminosäurekatabolie beteiligt und unterstützt die Energiehomöostase, indem es Substrate in den Citratzyklus (TCA-Zyklus) einspeist. Eine veränderte ACAT-1-Aktivität wurde mit angeborenen Störungen des Ketonkörperstoffwechsels und mit breiteren Phänotypen mitochondrialer Dysfunktion in Verbindung gebracht. ACAT1 wird daher häufig im Kontext metabolischer Umprogrammierung, von Nährstoffstressantworten sowie der Wechselwirkungen zwischen mitochondrialen Signalwegen untersucht, die für Neurodegeneration und die Bioenergetik von Krebszellen relevant sind.

ACAT-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ACAT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ACAT-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ACAT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ACAT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ACAT-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ACAT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ACAT-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ACAT-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ACAT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.