ABHD5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402273-ACT

Humanes ABHD5 (auch als CGI-58 bekannt) kodiert einen mit Lipidtröpfchen assoziierten Coaktivator, der die Mobilisierung neutraler Lipide mit dem zellulären Energiehaushalt koppelt, indem er die Aktivität der Adipose Triglyceride Lipase stimuliert und die Hydrolyse von Triacylglycerolen fördert. Durch die Regulation des Umsatzes von Lipidtröpfchen, des Fettsäureflusses und der nachgeschalteten mitochondrialen β‑Oxidation trägt ABHD5 zur Koordination der metabolischen Homöostase und der Lipidsignalgebung bei. Eine Störung der ABHD5-Funktion wird mit abnormaler Lipidspeicherung und ektoper Lipidakkumulation in Verbindung gebracht und verknüpft diesen Signalweg mit erblichen Phänotypen der neutralen Lipidspeicherkrankheit sowie umfassenderen Mechanismen metabolischer Erkrankungen. In onkologischen und entzündlichen Kontexten können durch ABHD5 beeinflusste Veränderungen des Lipidstoffwechsels und der Lipidtröpfchen-Dynamik die Membranzusammensetzung und Stressantworten neu ausrichten, was ABHD5 für die Pathway-Kartierung in unterschiedlichen Modellsystemen relevant macht.

ABHD5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ABHD5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ABHD5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ABHD5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ABHD5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ABHD5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ABHD5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ABHD5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ABHD5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ABHD5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.