4E-BP1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400398-ACT

EIF4EBP1 kodiert 4E-BP1, einen phosphorylierungssensitiven Repressor der cap-abhängigen Translation, der an EIF4E bindet und die Assemblierung des eIF4F-Komplexes begrenzt. Als zentraler nachgeschalteter Effektor der PI3K–AKT–mTOR-Signalübertragung integriert 4E-BP1 Signale von Wachstumsfaktoren, Nährstoffen und Stress, um die globale Proteinsynthese, das Zellwachstum und die metabolische Anpassung feinzujustieren. Die mTORC1-vermittelte Phosphorylierung von 4E-BP1 setzt EIF4E frei und fördert dadurch die Translation von Transkripten, die an Proliferation und Überleben beteiligt sind, wodurch die Regulation von EIF4EBP1 mit Proteostase und Zellzykluskontrolle verknüpft wird. Eine dysregulierte 4E-BP1-Aktivität und sein Phosphorylierungszustand werden häufig in der Krebsbiologie sowie im Kontext metabolischer Signalwege und Stressantworten untersucht, in denen eine Umprogrammierung der Translation zu krankheitsassoziierten Phänotypen beiträgt.

4E-BP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EIF4EBP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

4E-BP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EIF4EBP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EIF4EBP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen 4E-BP1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EIF4EBP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von 4E-BP1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des 4E-BP1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EIF4EBP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.