XPF CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401692-ACT

ERCC4 kodiert die menschliche strukturspezifische Endonuklease XPF, die mit ERCC1 ein Heterodimer bildet, um während der Nukleotid-Exzisionsreparatur (NER) den 5′-Schnitt auszuführen und DNA-Interstrang-Crosslinks über das Fanconi-Anämie/HR-Netzwerk zu verarbeiten. XPF erkennt verzweigte DNA-Strukturen und trägt zur Auflösung gestoppter Replikationsgabeln bei, wodurch die Genomstabilität unter endogenem und genotoxischem Stress aufrechterhalten wird. Eine Störung der ERCC4/XPF-Funktion ist mit DNA-Reparatur-Defizienzsyndromen verknüpft, darunter Xeroderma pigmentosum und verwandte progeroide Phänotypen, und ist für Studien zur Karzinogenese relevant, da die Entfernung von DNA-Läsionen beeinträchtigt ist und die Mutationslast steigt. Daher wird ERCC4 häufig in Modellen für UV-Schadensantworten, Crosslink-Reparatur, Replikationsstress und Checkpoint-Signalgebung untersucht.

XPF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ERCC4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

XPF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ERCC4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ERCC4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen XPF-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ERCC4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von XPF-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des XPF-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ERCC4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.