Plasmide CRISPR d'Activation (h2) WTX: sc-409039-ACT-2

Le gène humain AMER1 code la protéine WTX, un facteur associé à l’activité de suppresseur de tumeur qui régule la signalisation canonique Wnt/β-caténine en favorisant le renouvellement de la β-caténine et en coordonnant les composants du complexe de destruction. WTX participe également à l’organisation du cytosquelette et aux processus d’adhésion cellule–cellule, en assurant le lien entre l’échafaudage associé à la membrane et le contrôle transcriptionnel de programmes développementaux. Des altérations avec perte de fonction d’AMER1 sont impliquées dans la tumeur de Wilms et l’ostéopathie striée avec sclérose crânienne, et une perturbation d’AMER1 a été observée dans d’autres contextes cancéreux où la dérégulation de la voie Wnt favorise une prolifération aberrante. Des outils d’édition du gène AMER1/WTX et de perturbation fonctionnelle permettent des études mécanistiques de la transcription dépendante de Wnt, de la signalisation du développement et des relations génotype–phénotype dans des modèles rénaux et squelettiques.

WTX Le plasmide d'activation CRISPR (h2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de AMER1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

WTX Le plasmide d'activation CRISPR (h2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus AMER1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription AMER1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de WTX. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus AMER1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de WTX au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie WTX dans les cellules tumorales présentant une expression de AMER1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.