Plasmide CRISPR d'Activation (h) WSTF: sc-404237-ACT

Le gène humain BAZ1B code le facteur de transcription du syndrome de Williams (WSTF), une protéine nucléaire associée à la chromatine qui coordonne le remodelage dépendant de l’ATP et la phosphorylation de l’histone H2A.X lors des réponses aux dommages de l’ADN. WSTF agit au sein du complexe WICH avec SMARCA5 et contribue également au remodelage de la chromatine de la famille ISWI, reliant le positionnement des nucléosomes à la régulation transcriptionnelle et au maintien de la chromatine associé à la réplication. Par ces activités, BAZ1B influence la stabilité du génome, la progression du cycle cellulaire et des programmes d’expression génique dépendants de l’ARN polymérase II. Des altérations du dosage de BAZ1B et des états de chromatine dérégulés dépendants de WSTF ont été associées à des phénotypes neurodéveloppementaux ainsi qu’à des perturbations transcriptionnelles plus larges pertinentes pour la biologie des maladies.

WSTF Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de BAZ1B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

WSTF Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus BAZ1B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription BAZ1B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de WSTF. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus BAZ1B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de WSTF au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie WSTF dans les cellules tumorales présentant une expression de BAZ1B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.