WDR77 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403890-ACT

WDR77 (auch als MEP50 bekannt) kodiert ein WD-Repeat-Gerüstprotein, das als essenzieller Kofaktor von PRMT5 fungiert und die symmetrische Dimethylierung von Argininresten an Histonen sowie an diversen RNA-bindenden Proteinen koordiniert. Über diesen PRMT5–WDR77-Komplex trägt WDR77 zu Chromatin-Remodeling, transkriptioneller Regulation und RNA-Spleißprogrammen bei, die den Zellzyklusverlauf und die linienspezifische Genexpression steuern. WDR77-assoziierte Methylierungsnetzwerke überschneiden sich mit Signalwegen, die DNA-Schadensantworten und signalabhängige Transkription kontrollieren, und verknüpfen so epigenetische Regulation mit zellulären Proliferationszuständen. Eine Fehlregulation der PRMT5/WDR77-Aktivität und nachgeschalteter Methylierungssignaturen wurde in zahlreichen Krebs- und Entwicklungszusammenhängen beschrieben, was mechanistische Studien zur WDR77-abhängigen Genregulation motiviert.

WDR77 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen WDR77-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

WDR77 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des WDR77-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der WDR77-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen WDR77-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native WDR77-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von WDR77-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des WDR77-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem WDR77-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.