WBSCR16 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-413429-ACT

RCC1L (WBSCR16) kodiert ein mitochondriales RCC1-ähnliches Protein, das an der Koordination der Biogenese mitochondrialer Ribosomen beteiligt ist und die Kapazität der oxidativen Phosphorylierung unterstützt. Über Effekte auf die Assemblierung des Mitoribosoms und den mitochondrialen RNA-Stoffwechsel trägt WBSCR16 zur Aufrechterhaltung der mitochondrialen Proteostase und einer effizienten Funktion der Elektronentransportkette bei. Störungen dieses Signalwegs können die zelluläre Energiehomöostase, mitochondriale Stressantworten und nachgeschaltete, mit metabolischer Adaptation verknüpfte Signalgebung verändern. WBSCR16 wurde im Zusammenhang mit Phänotypen mitochondrialer Dysfunktion untersucht und ist für mechanistische Forschung zu Erkrankungen relevant, die mit beeinträchtigter mitochondrialer Translation und Atmung einhergehen.

WBSCR16 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RCC1L-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

WBSCR16 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RCC1L-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RCC1L-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen WBSCR16-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RCC1L-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von WBSCR16-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des WBSCR16-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RCC1L-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.