Plasmide CRISPR d'Activation (h) VPS13A: sc-407168-ACT

VPS13A code la protéine 13A associée au tri des protéines vacuolaires (vacuolar protein sorting-associated protein 13A), un grand facteur de transfert de lipides qui se localise aux sites de contact membranaires et contribue à l’homéostasie lipidique, à la dynamique des organites et au trafic vésiculaire. VPS13A est impliquée dans la communication entre mitochondries et réticulum endoplasmique, dans des processus liés à l’autophagie, ainsi que dans le maintien de l’intégrité des membranes neuronales et des érythrocytes via la régulation de la distribution des phospholipides. L’altération de la fonction de VPS13A est associée à des phénotypes neurodégénératifs et à la biologie des troubles du mouvement, notamment à la pathogenèse de la chorée-acanthocytose, et elle est de plus en plus étudiée dans le cadre des réponses au stress cellulaire et du remodelage membranaire. Ainsi, VPS13A constitue un point d’entrée mécanistique pour explorer les voies qui couplent le transport intracellulaire à la fonction mitochondriale et à la neurobiologie.

VPS13A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de VPS13A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

VPS13A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus VPS13A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription VPS13A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de VPS13A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus VPS13A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de VPS13A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie VPS13A dans les cellules tumorales présentant une expression de VPS13A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.