von Willebrand Factor/VWF Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400217-ACT

VWF codifica per il fattore di von Willebrand, una grande glicoproteina multimerica prodotta dalle cellule endoteliali e dai megacariociti, essenziale per l’emostasi primaria. VWF media l’adesione delle piastrine al collagene subendoteliale esposto in condizioni di elevato stress di taglio e stabilizza il fattore VIII della coagulazione, collegando l’ancoraggio piastrinico alla cascata coagulativa intrinseca. La proteina è immagazzinata nei corpi di Weibel–Palade e nei granuli α piastrinici ed è regolata dal processamento e dalla scissione dei multimeri, influenzando la trombosi e l’integrità vascolare. La disregolazione o le variazioni genetiche di VWF sono associate a fenotipi emorragici e trombotici ed è ampiamente studiata nella biologia endoteliale, nella funzione piastrinica e nella ricerca sui percorsi della coagulazione.

von Willebrand Factor/VWF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di VWF senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

von Willebrand Factor/VWF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus VWF nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione VWF, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di von Willebrand Factor/VWF. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus VWF nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da von Willebrand Factor/VWF nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via von Willebrand Factor/VWF nelle cellule tumorali con espressione di VWF silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.