VCAM-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400135-ACT

VCAM1 kodiert das vaskuläre Zelladhäsionsmolekül 1 (VCAM-1), einen induzierbaren Adhäsionsrezeptor der Immunglobulin-Superfamilie, der auf aktiviertem Endothel exprimiert wird und durch Bindung an Integrine wie VLA-4 (α4β1) eine feste Anheftung von Leukozyten sowie deren transendotheliale Migration vermittelt. Seine Expression wird durch entzündliche Zytokine über NF-κB- und MAPK-Signalwege stark hochreguliert und verknüpft damit die endotheliale Aktivierung mit dem Traffic von Immunzellen, Veränderungen der Gefäßpermeabilität und der Infiltration von Gewebe. VCAM-1 ist an Programmen der vaskulären Entzündung beteiligt, die sich mit Reaktionen auf oxidativen Stress sowie mit Zytokin-/Chemokin-Netzwerken überschneiden. Eine fehlregulierte VCAM1-Expression steht mit chronischen Entzündungszuständen, der Entwicklung atherosklerotischer Läsionen und Immuninteraktionen zwischen Tumor und Stroma in Zusammenhang und ist damit ein nützlicher molekularer Readout für endotheliale Aktivierung und die Biologie der Leukozytenrekrutierung.

VCAM-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen VCAM1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

VCAM-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des VCAM1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der VCAM1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen VCAM-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native VCAM1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von VCAM-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des VCAM-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem VCAM1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.