VAMP-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401607-ACT

VAMP1 kodiert das vesikelassoziierte Membranprotein 1 (VAMP-1), ein SNARE-Protein der Synaptobrevin-Familie, das das Andocken synaptischer Vesikel und die Membranfusion vermittelt, die für die Ca2+-getriggerte Neurotransmitterfreisetzung erforderlich sind. VAMP-1 ist an zentralen präsynaptischen Exozytosewegen beteiligt, indem es SNARE-Komplexe mit Syntaxinen und SNAP-25 bildet und dadurch einen schnellen Vesikelzyklus sowie die synaptische Transmission unterstützt. Eine Störung der VAMP1-abhängigen Vesikelfusion beeinträchtigt die neuronale Kommunikation und wurde mit neuroentwicklungsbezogenen und neuromuskulären Phänotypen in Verbindung gebracht, was VAMP1 für die Untersuchung synaptischer Dysfunktionen relevant macht. In humanen Zellmodellen ist die Regulation von VAMP1 zudem nützlich, um die Dynamik des Membrantransports und aktivitätsabhängige Sekretion zu untersuchen.

VAMP-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen VAMP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

VAMP-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des VAMP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der VAMP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen VAMP-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native VAMP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von VAMP-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des VAMP-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem VAMP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.