Plásmido CRISPR de Activación (h) V-ATPase α1: sc-403882-ACT

ATP6V1A codifica la subunidad α1 de la V-ATPasa, un componente central del sector citosólico V1 que acopla la hidrólisis de ATP a la translocación de protones por el complejo H⁺-ATPasa vacuolar. Esta enzima acidifica endosomas, lisosomas y vesículas secretoras, lo que respalda la endocitosis mediada por receptores, el flujo autofágico, el tráfico de membranas y el procesamiento de proteínas, y además contribuye a la homeostasis del pH en la membrana plasmática en contextos especializados. Al controlar la acidificación de los orgánulos, la actividad de la V-ATPasa influye en la detección de nutrientes y en programas de señalización, incluidas vías vinculadas a la regulación de mTORC1 y a la maduración de vesículas. La acidificación vacuolar desregulada y la función alterada de ATP6V1A se han asociado con fenotipos relevantes para la neurobiología, la biología del cáncer y las interacciones huésped–patógeno, lo que la convierte en una diana útil para estudios mecanísticos de la proteostasis y del transporte intracelular.

V-ATPase α1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ATP6V1A sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

V-ATPase α1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ATP6V1A en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ATP6V1A, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de V-ATPase α1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ATP6V1A y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de V-ATPase α1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía V-ATPase α1 en células tumorales con expresión de ATP6V1A silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.