Plásmido CRISPR de Activación (h) V-ATPase A2: sc-406000-ACT

ATP6V0A2 codifica la isoforma a2 de la subunidad a del dominio V0 de la ATPasa vacuolar de H+ (V-ATPasa), una bomba de protones multisubunidad que acidifica endosomas, lisosomas y compartimentos secretores. Al regular el pH de los orgánulos, la V-ATPasa A2 favorece la endocitosis mediada por receptores, el tráfico vesicular, el procesamiento de proteínas y las vías de degradación dependientes de lisosomas que influyen en la homeostasis celular. La actividad de ATP6V0A2 también afecta el ensamblaje de la matriz extracelular y procesos secretores asociados a la glucosilación, vinculando la acidificación compartimental con la organización tisular. La alteración o desregulación de ATP6V0A2 se ha asociado con trastornos congénitos que afectan la integridad del tejido conectivo y la glucosilación, lo que la hace relevante para estudios sobre el control del pH intracelular y la biología de la vía secretora.

V-ATPase A2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ATP6V0A2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

V-ATPase A2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ATP6V0A2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ATP6V0A2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de V-ATPase A2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ATP6V0A2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de V-ATPase A2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía V-ATPase A2 en células tumorales con expresión de ATP6V0A2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.