URE-B1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404890-ACT

HUWE1 kodiert URE-B1, eine E3-Ubiquitin-Ligase vom HECT-Typ, die die Protein-Homöostase reguliert, indem sie den Ubiquitin-Transfer auf zahlreiche Substrate katalysiert, die an Zellzyklusprogression, DNA-Schadenssignalgebung, Apoptose und Stressantworten beteiligt sind. Über die Kontrolle des ubiquitinabhängigen Abbaus beeinflusst HUWE1 Signalwege, die mit Chromatindynamik, MYC- und p53-assoziierten Netzwerken sowie mitochondrialen und proteotoxischen Stress-Checkpoints verknüpft sind. Eine veränderte HUWE1-Aktivität oder -Expression wurde mit dysregulierter Proliferation und beeinträchtigter Genomintegrität in Verbindung gebracht, und genetische Variation in HUWE1 wurde in neuroentwicklungs- und krebsbezogenen Kontexten beschrieben. Als zentraler Knotenpunkt der Ubiquitin-Signalgebung wird URE-B1 häufig untersucht, um substratspezifische Ubiquitinierung und Pathway-Crosstalk in menschlichen Zellen zu analysieren.

URE-B1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HUWE1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

URE-B1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HUWE1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HUWE1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen URE-B1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HUWE1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von URE-B1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des URE-B1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HUWE1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.