UPIb CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404274-ACT

UPK1B kodiert Uroplakin-1B (UPIb), ein tetraspaninähnliches integrales Membranprotein, das sich mit anderen Uroplakinen zu urothelialen Plaques auf der apikalen Oberfläche von Schirmzellen (Umbrella Cells) zusammenlagert. Diese Plaques tragen zur Integrität der epithelialen Barriere, zur Organisation der Membran und zu vesikulären Transportprozessen bei, die das Oberflächen-Remodeling im Harntrakt regulieren. Die Expression von UPK1B ist stark in differenziertem Urothel angereichert und wird häufig als Marker der urothelialen Zelllinie sowie von epithelialen Differenzierungsprogrammen verwendet. Veränderte Uroplakin-Expressionsmuster wurden bei urothelialen Pathologien beschrieben und im Kontext der Homöostase des Blasenepithels, von Metaplasie und tumorassoziierten Veränderungen des Differenzierungszustands untersucht.

UPIb Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen UPK1B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

UPIb Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des UPK1B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der UPK1B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen UPIb-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native UPK1B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von UPIb-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des UPIb-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem UPK1B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.