tricellulin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-414734-ACT

MARVELD2 kodiert Tricellulin, ein vierfach transmembranes Membranprotein, das an trikellularen Tight Junctions angereichert ist, also dort, wo drei Epithelzellen aufeinandertreffen. Tricellulin trägt zur Integrität epithelialer und endothelialer Barrieren bei, indem es Junction-Komplexe organisiert und den parazellulären Stofffluss reguliert – im Zusammenspiel mit Claudinen, Occludin und Gerüstproteinen wie ZO-1. Über seine Rolle beim Aufbau von Tight Junctions und bei der Etablierung der Polarität beeinflusst MARVELD2 Prozesse wie epitheliale Differenzierung, Mechanotransduktion und Gewebehomöostase. Eine Fehlregulation oder genetische Variation von MARVELD2 wurde mit barrierebezogener Pathophysiologie in Verbindung gebracht, darunter syndromale und nichtsyndromale Formen von Hörverlust, was das Gen für Studien zu sensorischen Epithelien und Mechanismen junction-assoziierter Erkrankungen relevant macht.

tricellulin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MARVELD2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

tricellulin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MARVELD2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MARVELD2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen tricellulin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MARVELD2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von tricellulin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des tricellulin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MARVELD2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.